本文译自：L. D. Mech, C. S. Asa, M. Callahan, B. W. Christensen, F. Smith, J. K. Young. PLOS ONE, 12(9), 2017, e0184342. 译者：椰狼乐乐

注1：此文献翻译乃使用通俗易懂语言进行的意译，在不改变原文大意的基础上，通过较简单的语言，同时调整部分内容进行翻译，旨在便于读者理解并引起兴趣。注意：鉴于译者水平所限，故不保证译文的准确度，如有误译请指出。此译文不可用作正式文献进行引用，如有需要，请引用原始文献。

注2：“椰狼”为译者所起的昵称，指灰狼与郊狼的杂交子代，同时也是本人兽设，此非正式命名！

【资料图】

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基于人工受精技术获得的灰狼x郊狼杂交子代的研究

摘要

研究者通过使用北美西部灰狼的精子，通过人工受精技术，使西部郊狼受孕，并成功诞下7只杂交幼崽，其中6只存活至今（2017年），他们时年四岁。此外，通过使用其中一只杂交子代与父本灰狼进行回交，再次成功诞下6只幼崽，截至论文完稿时他们已十个月大。

对于子一代椰狼，所有雄性个体在十个月大时即产生形态、活力良好的可育精子。不过椰狼与椰狼通过直系近亲繁殖产下的子二代个体，在其10个月大时产生的精子活力不佳，但是在22个月大时得以恢复正常。这项研究与来源和分类学上长期以来存在巨大争议的物种——红狼（Canis rufus）、东加拿大狼（Canis lycaon），以及杂交行为在哺乳动物进化过程中起的作用有关。

前言

60多年以来，关于红狼的生物分类学地位及其遗传特性，一直存在相当大的争议。在过去的20年里，类似的争议也发生在了东加拿大狼身上——东加拿大狼究竟是灰狼的亚种（Canis lupus lycaon）还是独立的物种（Canis lycaon）呢？至今尚无定论。在这些争议之下，一些研究人员将目光集中在了郊狼（Canis latrons）与灰狼（Canis lupus）的杂交上，并且最近的研究指出，经过对28种犬属动物的全基因组序列的分析，无论是红狼还是所谓的东加拿大狼，都高度地混合了灰狼和郊狼的血统。时至今日，这些争议仍在持续。

在分子遗传学诞生之前，关于红狼和灰狼、郊狼之间关系的争议，主要是基于形态学和头骨测量的结果之间展开，有学者总结道：“有理由认为，当收集足够的证据之后，红狼会被发现其实就是灰狼x郊狼的杂交产物，并且是可育的。”而现在，即使在分子遗传学发展之后，争议仍然在持续。

不仅是红狼，关于东加拿大狼的争议也不断。传统认为东加拿大狼是灰狼的亚种（Canis lupus lycaon），但是在Wilson等人对红狼和东加拿大狼进行了分子遗传学分析后，他们发现了来自郊狼的线粒体DNA单倍型——这些单倍型曾被Lehman等人在北美灰狼中发现，并且，由于线粒体DNA只通过母系遗传，因此这些单倍型成为了雄性灰狼与雌性郊狼杂交的确切证据。基于此，Wilson等人认为红狼和东加拿大狼这两个物种与郊狼的关系，要比他们与灰狼的关系更近，并且他们与郊狼可以继续杂交。Wilson等人认为，这些单倍型仍然来自于东加拿大狼，而不是来自郊狼，东加拿大狼是与北美郊狼和红狼平行演化的独立物种，即Canis lycaon，而不是Canis lupus lycaon。当然，这一发现和说法受到了其他分子遗传学研究结果和解释的挑战，例如，在红狼和东加拿大狼中都发现了确切来自郊狼的线粒体DNA单倍型。

关于红狼和东加拿大狼的争议一直持续至今，并且愈演愈烈，不时有新的发现、挑战、解释和说法产生。基于此，非常有必要通过实验确定灰狼和郊狼的杂交结果、杂交子代的生长情况以及他们是否可以与灰狼回交。

广义上的“灰狼与郊狼杂交”这个概念是相当复杂的，这是因为，北美东部的郊狼和东部灰狼的行为，与北美西部郊狼和西部灰狼的行为是大相径庭的。图1描述了这些西部犬属动物和东部犬属动物的总体分布情况。

在此之前，G. B. Kolenosky等人已经报导了圈养状态下，东部郊狼与东部灰狼成功杂交的案例；即使在野外，东部郊狼与东部狼也会杂交，只是这种杂交通常发生在公郊狼和母狼之间（译者注：民间传闻的郊狼与灰狼的自然杂交常发生在公狼与母郊狼之间实为误传，事实上这种行为反而通常发生在母狼与公郊狼之间，这可能因为人们往往认为体型更大的母狼不会看上小巧的公郊狼，但动物界的规则往往与人的主观认知相悖；不过，也有一种说法是由于母郊狼的体型过小，与公狼杂交的母郊狼会因胎儿过大难产而导致子代甚至母本发生死亡，因此自然界中公狼与母郊狼的杂交子代是很少见的，这一点在本论文作者的实验中有间接的证实：三只怀孕的母郊狼中，有两只都出现了因难产而无法诞下幼崽，或者虽诞下幼崽但被母郊狼吃掉的情况）。不过截至目前，除了来自亚利桑那州和墨西哥的三个头骨这样间接的、可能的证据外，无论在野外还是圈养状态下，并没有确切的西部郊狼与西部灰狼直接杂交的记录。与东部狼不同的是，西部灰狼不但不会与西部郊狼交配，反而倾向于杀死郊狼。

在自然界中，除了在线粒体DNA中发现的间接证据，没有直接的公灰狼与母郊狼杂交的案例，无论是东部还是西部。因此，在野外，除了可能是公狼看不上母郊狼的原因外，更有可能是公狼和母郊狼杂交的情况虽然有可能发生，但是相比母灰狼来说，母郊狼产仔的存活率要远低，因此自然界中成功的杂交通常仅发生在母狼与公郊狼之间。

来自母郊狼的线粒体DNA在加拿大东南部至明尼苏达州西部的狼的样本中被发现。根据这些在狼的样本中发现的不同线粒体DNA单倍型的数量，Lehman得出的结论是：公狼和母郊狼在自然界中杂交的情况是跨地域存在的，在这些样本中就发生了至少六次，而vonHoldt等人测算，这种杂交行为大致发生在546至963年前。然而，上述证据与目前在自然界中找不到公狼和母郊狼杂交的直接案例相悖。那么一个重要的问题来了——虽然东部郊狼可以与灰狼杂交（尽管这种杂交在自然条件下通常发生在公郊狼和母灰狼之间），但是西部灰狼是否可以与西部郊狼杂交？如果可以，那么杂交子代会否存活，并且可育？

为了搞明白这个难题，研究人员取出西部灰狼的精子，来对西部的郊狼进行人工受精，结果三只郊狼成功受孕。然而，一只子代（可能是由于体型太大）难产，破腹产后未能挽救；一只虽然产下多达八只子代，但是母郊狼强烈而持续的剧痛使得她在24小时内将幼崽全部吃掉；第三只郊狼成功产生并繁育了6只幼崽，充分证明了西部灰狼在生理学上是完全可以与西部郊狼杂交的，但是，该结果并不能证明在自然状态下，雄性西部灰狼和雌性西部郊狼会主动交配繁殖。此外，雌性西部郊狼会哺育和照顾幼崽（嗯，也会吃掉他们）。若西部灰狼与西部郊狼杂交的子代是美国中西部和南安大略省的郊狼个体中的线粒体DNA的来源，那么这种杂交一定是可行的、可育的，并且能够与狼回交，从而产生杂交种群。

本研究的目的是证明西部灰狼与西部郊狼的杂交子代——西部椰狼可以在圈养条件下生长，并且椰狼之间可以近亲繁殖并继续产生子代并生长；并且能够通过人工受精使得子一代与其父本回交并得到子代，并且这种回交子代与（另一只西部灰狼与西部郊狼）的杂交子代近亲繁殖继续得到子代并存活。在这一系列完完全全的直系近亲繁殖的骚操作下，仍然可以得到子代，并且大部分都成功存活和生长、繁殖，这充分说明西部公灰狼不仅可以与西部母郊狼杂交并产生后代，并且子代还可以成功地长大且继续可育，并且还可以与灰狼回交。这进一步支持了这一假设——美国中西部灰狼体内的郊狼线粒体DNA很可能是西部灰狼与西部郊狼在过去的某个时间段内杂交产生的。同时这一研究还支持了可能证明红狼和东加拿大狼是灰狼和郊狼杂交产物的新基因组的发现（译者注：目前，全基因组序列等遗传学证据表明，红狼是杂交物种的可能性已基本排除，应该是独立物种，很可能是来自与郊狼最近共同祖先的演化枝，只是红狼通常高度混合有灰狼和郊狼的血统，与此同时，东加拿大狼是杂交物种的可能性在变大）。

总之，我们的研究对于认识哺乳动物在进化过程中的杂交规律很有启发，因为在目前所有陆生哺乳动物杂交的报道中，灰狼和郊狼的杂交在地理上的分布范围是最大的。通过实验得到杂交子代也可以解释分子遗传学研究的结果，包括有关基因调控和表观遗传变异的研究结果等。

实验材料和方法

本研究中，雄性西部灰狼个体是在不列颠哥伦比亚省野外的一个洞穴中捕获的，雌性西部郊狼则是圈养的个体，其血统来自犹他州或爱达荷州捕获的野生郊狼。成年西部公灰狼的体重大约70公斤，主要以有蹄类动物为食；西部郊狼重仅约20公斤，以啮齿目、兔形目及其他较小的猎物为食，他们的生存范围大部分与狼是重叠的。

六只子一代的椰狼与其郊狼母亲一起在犹他州的圈养条件下生存了13天，然后将他们运送至明尼苏达州哥伦布市的野生动物研究中心进行圈养。在旁边的另一个围栏中还圈养了那只提供精子、通过人工受精产生子一代椰狼的灰狼，在本研究中该灰狼将被用于回交实验。我们参照XXX（从略）指南来饲养和护理实验动物。

根据USDA-APHIS法规，我们将研究动物圈养在0.23公顷的自然植被和庇护所围栏中，我们提供食物、提供水（从略）、驱虫处理、按时喂食寄生虫预防剂，每6个月注射一次praziquantal Nada 111-607，每年接种Novibak疫苗，每2年接种RABAVERT（不懂，从略）。

当杂交物种接近10个月大、22个月大以及4岁大时，采集他们的JY进行分析，精子的活力、质量（正常形态百分比）、浓度如表一所示。此外，在本研究中，我们还分别在2015年3月和2016年2月，即在两只雄性子二代分别达到10个月和22个月大时采集了JY，其活力、质量和浓度如表二所示。

在这项研究中，使用的郊狼及其子一代雌性杂合体CW6均使用deslorelin implant以便定期排卵，父本灰狼Wolf 487在16年2月15日通过人工受精技术与CW6进行回交实验。回交后代的测量是在25周龄时进行的。

结果

截至17年8月10日，原始杂交实验的两个雌性个体CW1、CW6和四个雄性个体CW2、CW3、CW4、CW5均存活了四年以上。在这些椰狼刚满一岁时，雌性个体CW1和不知道哪个雄性椰狼发生了意外交配，并在14年4月27日产下两个雄性子二代。他们跟着母亲，直到14年5月8日被带走进行人工饲养。截至完成本论文时，这两个子二代均存活。在16年2月16日，这两个意外产物的体重分别为20.5公斤和25.0公斤。为了避免类似的事件发生，我们在15年和16年将子一代的雄性个体和雌性个体分开进行圈养。在17年，我们再次将他们圈养在一起，然后雌性个体CW1果然再次不负众望，与她的兄弟进行杂交并产下了7个幼崽，其中3只雌性、4只雄性。我们在12日龄时，把3只雌性个体和其中的两只雄性个体抱走进行人工饲养，其中一只雌性个体体质虚弱（可能是直系近亲繁殖的缘故）并死亡。剩余的6个个体，无论是人工饲养的还是跟随母亲的，全部成活。

注：“AI”表示人工受精；椭圆形表示雌性个体，矩形代表雄性个体；“CW1*”表示是雌性个体CW1可能是同其兄弟CW2、CW3、CW4或CW5中的任何组合进行的杂交，虚线对应本研究的时间线。

通过对JY的采集和分析，结果表明，在10个月大的时候，所有子一代的雄性个体（CW2、CW3、CW4和CW5）的精子均完全可育；但是对于子二代的两个个体，在10个月大的时候其精子形态和活力较低；不过，当个体成长到22个月大的时候情况得到改善。其中一只雄性个体的精子质量和活力达到了子一代个体的平均值，表明正常可育。但是另一只雄性个体的精子活力虽然不错，但是正常形态百分比只有55%，稍低于家犬精子的正常可育范围的下限（60%），属于亚可育状态。

我们通过将雄性西部灰狼（Wolf 487）的精子人工授精给子一代的CW6杂合体来进行回交，在16年4月15日，成功得到了六只回交子代，其中两只雄性、四只雌性。在13日龄之前，他们一直跟随着其母亲（CW6），进行哺育和照顾，到13日龄时，我们抱走了其中五只幼崽，只留下一只雄性个体（006）继续接受其母亲的喂养。在撰写本论文时，除了一只人工饲养的雄性个体（003）在16年8月死于犬免疫介导的溶血性贫血，所有其他个体均得到存活。

在2017年，雌性个体CW6与她（和其父亲通过人工受精得到的）儿子（006）在自然状态下发生回交，并产下五个子代，其中一个雌性个体和四个雄性个体。我们将雌性个体和其中两只雄性个体在他们12日龄时抱走进行人工养育。不幸的是唯一的雌性个体体质虚弱并死亡（可能是由于近亲繁殖的缘故），截至发稿时所有其他雄性个体都成活下来。

讨论

这项研究是在人员和设备可用的情况下进行的机会性研究，因此，一些例如关于他们生长、发育和行为的理想数据无法被收集到。此外，文中报告的所有杂交行为，除了通过人工受精进行的杂交之外，所有这些行为都是意外发生的（译者注：？？？）。每个杂交过程均为独一无二的两只动物，因此没有重复。但是尽管如此，我们仍然记录了足够的信息来证明西部灰狼和西部郊狼之间可以发生杂交及这些杂交行为会发生的程度。

尽管在圈养状态下，我们可以让这些椰狼自然交配，但是出于种种原因，我们不能这样（译者注：但你们还是这样了，甚至发生了三次意外）。因此，我们在早期和现在的实验当中均使用了人工受精技术。我们的研究结果清晰的表明，西部灰狼与西部郊狼杂交得到的子一代物种生长良好，正常可育，甚至在1岁时就可以自主进行交配并繁殖。——多数的郊狼都会在1岁大的时候进行繁殖，但是灰狼则很少这样，他们繁殖时间更晚。无论是子一代的JY样本还是得到子二代这一直接证据，都证实了子一代是完全可育的。虽然子二代的精子在10个月龄大时形态不佳、活力过低，但在22月龄时得到改善。——其中一只子二代为正常可育，尽管还有一只子二代的精子在22个月时正常形态占比仍然较低（55%），低于一般认为的可育范围的下限60%，应当属于亚可育状态，但是，这很有可能是近亲繁殖造成的——因为另一只子二代的精子已经具有了良好的形态与活力。而且在墨西哥灰狼和其他物种中，也已经证实精子的活力和形态不佳与近亲繁殖有关。

这项研究尽管只在一对西部郊狼与灰狼之间进行，但结果清楚地表明如果西部灰狼愿意和雌性西部郊狼进行杂交的话，是可以繁殖出可育的后代的，并且子代仍然可以存活和繁殖。而且也证实了，至少在圈养状态下，这些杂交后代之间会进行自然交配。另一方面，通过人工受精，雌性的杂合子一代和雄性的灰狼父本也可以杂交。但是，正如前面所强调的那样，我们的研究【并不能证明】：在野外或圈养条件下，西部郊狼与西部灰狼之间会进行或乐意进行自然杂交。截至目前，即使在圈养状态下，也没有西部灰狼与西部郊狼进行自然杂交的记录，仅有的文献只限于上文提到的那几个可能的、间接的杂交证据，没有直接证据，包括来自亚利桑那州和墨西哥的三个头骨，这些间接的证据只能说明：可能曾经有西部灰狼与西部郊狼在野外杂交过，但是即使真的有这种情况，这种杂交行为也是很少发生的。也即虽然生理学上二者无生殖隔离，但是行为学上有。

况且，雄性西部灰狼和雌性西部郊狼之间自然交配的情况几乎不太可能发生。这是因为首先，正如前文所指出的那样，通常西部灰狼看郊狼非常不爽，他们会驱赶或者杀死郊狼。其次，姿势问题，雄性西部灰狼体重最大可接近80公斤，但是雌性西部郊狼的体重很少超过20公斤，因此……太难了。即使非要杂交，由于自然界不比圈养环境，这种情况下雌性郊狼及其子代也很可能因胎儿过大难产致死。

对于郊狼的线粒体DNA究竟是如何跑到西部灰狼体内的，另一种可能的解释是在过去，有一只超大号的雄性郊狼与一只小号的雌性西部灰狼之间发生交配，由此得到雄性的杂交子一代，然后得到的子一代雄性个体体型适中，可与雌性郊狼杂交，从而产生具有郊狼线粒体DNA的杂合体。这些椰狼中的雌性个体体型大于正常的雌性郊狼，可能可以与雄性灰狼进行杂交，从而得到不但具有灰狼核DNA还具有郊狼线粒体DNA的个体。（简称：套娃）

我们实验得到的子一代个体都很健康，并能互相自然杂交得到健康的后代，这一事实表明，在野外，杂交子代之间的杂交或许已经发生。我们通过人工受精使雌性杂合体产下健康的后代表明，至少这两个物种的配子是相容的（尽管行为上未必发生），而且虽然有雌性个体会吃掉幼崽，但是大部分都会养育她们的后代。可能此处会有争议——我们的动物都是人工圈养的，生存条件优越，因此更容易存活，但这并不意味着在野外的恶劣环境中，这些个体仍然可以存活。然而，鉴于郊狼和灰狼具有高度的智力、超强适应性和生存能力，很难相信这些杂合体在野外不能生存。例如实际上是东部狼和郊狼杂交子代的北美东北郊狼，分布越来越广泛，甚至严重威胁到了红狼种群的血统。

对于雄性西部灰狼是否会与雌性西部郊狼在野外自然杂交，Mech等人提出了六个可能的研究问题。我们的这项研究肯定的回答了其中的两个问题，其一是雄性西部灰狼可以使雌性西部郊狼受精并产生后代；其二是这些子代是可育、并且会主动交配和繁殖的。下一步的工作需要将雄性西部灰狼和雌性西部郊狼圈在一起饲养，以确定他们是否会进行自然交配并产生后代。

目前已有东部狼和郊狼之间杂交的研究，但是目前还没有雄性西部郊狼与雌性西部灰狼之间的杂交研究（与本文的研究刚好相反），而且目前也没有遗传学方面的直接证据证明这类自然杂交已经发生。因此，我们建议展开这类研究。尽管由于个体大小悬殊，导致自然交配难以进行，但是类似的杂交既然已经在东部狼和郊狼之间进行，那么在西部狼和郊狼之间很可能也是可以的。当然，也可以考虑使用人工受精。最终的结果或许会进一步认识郊狼和灰狼杂交这一有趣的课题，乃至可能给包括红狼和东加拿大狼等具有巨大争议的物种的分类学地位等提供宝贵的建议。

致谢、参考文献

（从略）。

附图：本论文中各个杂交子代的模样：

全文完。